Die Nukleinsäureextraktion ist der erste Schritt im NGS-Probenvorbereitungsprotokoll. Nukleinsäuren sind große Biomoleküle, die für alle bekannten Lebensformen essentiell sind. Sie bestehen aus Nukleotiden, Monomeren, die aus drei Komponenten bestehen – einem Zucker, einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen Base. Die beiden Hauptklassen von Nukleinsäuren sind DNA und RNA. Der Zucker der RNA ist Ribose, der der DNA Desoxyribose.
Ein Diagramm zeigt die Struktur von RNA (links) und DNA (rechts). Uracil ist die Base, die in der RNA mit Adenin gepaart ist, während Thymin in der DNA mit Adenin gepaart ist. Bildnachweis: Wikipedia
Arten der Nukleinsäureextraktion
Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion
Nachdem die Zellstruktur der Nukleinsäure aufgebrochen wurde, werden die zellulären Nukleasen mittels DNase und RNase inaktiviert. Anschließend können die gewünschten Nukleinsäuren von den Zelltrümmern getrennt werden.
Phenol allein ist eine brennbare, ätzende und giftige Karbolsäure. Eine Mischung aus Phenol, Chloroform und einer geringen Menge Isoamyl kann jedoch zur DNA-Extraktion verwendet werden. Durch Zugabe von Phenol und Chloroform zur Probe bildet sich eine Emulsion, die aufgrund ihrer hydrophilen Eigenschaften eine DNA-Schicht an der Oberfläche enthält. Die DNA kann anschließend gesammelt und durch Zentrifugation ausgefällt werden. Das entstandene DNA-Pellet kann anschließend mit sterilem Wasser aufgelöst werden.
Ein Diagramm zeigt die Schritte der Phenol-Chloroform-Extraktion: Zugabe der Phenol-Chloroform-Mischung zum Zelllysat, Zentrifugation und anschließendes Waschen mit Wasser, um die isolierte DNA zu erhalten. Bildnachweis: Eva Meszaros, 2021
Die Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Technik ermöglicht die Extraktion von RNA in einem einzigen Schritt. Die Trennung von RNA und DNA erfolgt nach der Extraktion mit einer sauren Lösung aus Guanidiniumthiocyanat, Natriumacetat, Phenol und Chloroform. Die RNA wird durch Fällung mit Isopropanol gewonnen – dies erzeugt einen sauren Zustand, bei dem die RNA oben in der Mischung verbleibt.
Cäsiumchlorid/Ethidiumbromid-Gradientenzentrifugation
Die Gradientenzentrifugation mit Cäsiumchlorid und Ethidiumbromid wird seit 1950 in Forschungslabors eingesetzt. Bei dieser Methode werden die unterschiedlichen Dichten der Cäsiumionen und des Wassers sowie die Interkalation von Ethidiumbromid ausgenutzt, um die Replikation, Transkription, Reparatur und Rekombination von DNA zu stören.
Diese Gradientenzentrifugation ist im Vergleich zu anderen Isolierungsprotokollen eine komplizierte, teure und zeitaufwändige Methode. Sie erfordert eine große Probenmenge und ist daher nicht für alle Sequenzierungsarten geeignet. Zudem ist Ethidiumbromid schädlich. Daher wird diese Methode aufgrund ihrer Einschränkungen im klinischen Labor nicht eingesetzt.
Festphasenextraktion
Die Festphasen-Nukleinsäurereinigung ist in den meisten kommerziellen Extraktionskits enthalten. Sie erfolgt üblicherweise mithilfe einer Spin-Säule, die unter Zentrifugalkraft betrieben wird, wodurch die DNA schnell und effizient gereinigt werden kann. Die Säule muss zunächst für die Probenaufnahme konditioniert werden, was mit einem Puffer bei einem bestimmten pH-Wert möglich ist. Nach dem Aufschluss der Zellen adsorbieren die gewünschten Nukleinsäuren aufgrund des pH-Werts der Bindungslösung an der Säule. Verunreinigungen werden anschließend durch Waschen mit einem kompetitiven Reagenz entfernt, und Wasser wird hinzugefügt, um die gewünschten Nukleinsäuren von der Säule freizusetzen.
Reinigung auf Basis magnetischer Kügelchen
Die magnetische Separation gilt heute als einfache und effiziente Methode zur Reinigung von Nukleinsäuren. Sie ist eine Abwandlung der Festphasenextraktion. Die Kügelchen haben eine negative Oberflächenladung und binden selektiv an Proteine wie DNA. Der Bindungsprozess kann manchmal durch einen Magneten an der Röhrchenwand unterstützt werden, da dieser die Partikel in Wandnähe aggregiert. Der Rest der Probe, bestehend aus Zelltrümmern und unerwünschtem Material, kann anschließend entsorgt werden. Die Nukleinsäuren werden mit einem Puffer von den magnetischen Partikeln getrennt und verbleibende Verunreinigungen ausgewaschen.
Ein Diagramm, das das Reinigungsprotokoll auf Basis magnetischer Kügelchen zeigt. Bildnachweis: Andrew Gane, 2019
Diese Methode bietet zweifellos Vorteile: Sie erfordert keine wiederholte Zentrifugation, Vakuumfiltration oder Säulentrennung und ist daher zeit- und kosteneffizient. Zahlreiche kommerzielle Kits sind erhältlich, wobei einige Hersteller sogar Magnetkügelchen mit anderen Festphasenextraktionstechniken kombinieren, darunter auch die Verwendung von Kieselgel. Solche Technologien helfen Wissenschaftlern, indem sie die DNA-Rückgewinnung mit nur geringen Probenmengen verbessern.
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